免疫印跡試驗(yàn)（western blotting）
免疫印跡法是一種通過(guò)凝膠電泳分離蛋白質(zhì)并通過(guò)電轉(zhuǎn)移把蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到吸附膜上。一經(jīng)蛋白印跡后，即可通過(guò)特異性的標(biāo)記抗體檢測(cè)到相應(yīng)蛋白質(zhì)。
十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）可用于檢測(cè)已被SDS化學(xué)變性的蛋白。然而，某些特定的抗體不會(huì)在一個(gè)變性的蛋白質(zhì)分子上識(shí)別其抗原表位，這時(shí)需要進(jìn)行不含SDS的聚丙烯酰胺凝膠電泳。
蛋白印跡轉(zhuǎn)膜可以通過(guò)濕法或半干法進(jìn)行。在前者，凝膠夾在印跡膜和各種過(guò)濾裝置中間，然后把整個(gè)裝置埋進(jìn)一個(gè)裝滿Tris轉(zhuǎn)移緩沖的電極槽中。在后者，夾在中間的凝膠周圍只有少量的緩沖液，然后封閉在電極板之間。雖然半干法轉(zhuǎn)膜較快，但需要很好地?cái)M合各部分的夾層配件，而濕法轉(zhuǎn)膜很少會(huì)出現(xiàn)問(wèn)題，可以盡量保持重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的一致性。此外，如果半干法轉(zhuǎn)膜時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，較小分子量的蛋白質(zhì)可能會(huì)從膜上轉(zhuǎn)過(guò)。
轉(zhuǎn)膜后，需對(duì)膜進(jìn)行封閉，以減少非特異性蛋白結(jié)合，然后進(jìn)行用一抗孵育膜，以研究感興趣的目標(biāo)蛋白。單克隆抗體通常具有更高的特異性；然而許多單克隆抗體產(chǎn)生于某個(gè)特定肽段而不是一個(gè)天然蛋白質(zhì)，因此可能無(wú)法檢測(cè)到PAGE所分離的天然蛋白。也可使用多克隆抗體，但易形成較高的背景值。因一抗通常無(wú)標(biāo)記，所以需要一個(gè)可以結(jié)合在一抗Fc段的標(biāo)記的二抗，以用于最后的檢測(cè)。通常會(huì)用酶來(lái)標(biāo)記二抗。酶標(biāo)記后的印跡可通過(guò)化學(xué)發(fā)光酶底物及放射自顯影技術(shù)成像。被抗體檢測(cè)和標(biāo)記到的蛋白質(zhì)會(huì)出現(xiàn)在圖像的暗區(qū)。
斑點(diǎn)印跡法類似于免疫印跡法，在膜上檢測(cè)目標(biāo)蛋白；但是斑點(diǎn)印跡法中檢測(cè)的蛋白質(zhì)不用電泳進(jìn)行分離。取而代之的是，含有目標(biāo)蛋白的樣品被直接“點(diǎn)”到膜上，這不能做到定量檢測(cè)，但它可以直接檢測(cè)某種特定蛋白的有無(wú)。例如，斑點(diǎn)印跡法可用于檢測(cè)蔗糖梯度分離的細(xì)胞裂解產(chǎn)物中的某些蛋白質(zhì)定位。
免疫印跡試驗(yàn)常見(jiàn)的問(wèn)題及原因
1、沒(méi)有條帶
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可能存在的原因 |
解決方法 |
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抗體不足 |
抗體與蛋白的親和不高，加大抗體的濃度；抗體活性降低，斑點(diǎn)實(shí)驗(yàn)。 |
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蛋白量不足 |
增加蛋白的上樣量；其他途徑測(cè)定蛋白含量；添加一個(gè)陽(yáng)性對(duì)照；斑點(diǎn)實(shí)驗(yàn) |
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蛋白轉(zhuǎn)移失敗 |
PVDF：甲醇激活，NC和PVDF在轉(zhuǎn)膜液中浸泡；保持膜與膠之間的無(wú)氣泡接觸。 |
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蛋白轉(zhuǎn)移率低 |
優(yōu)化轉(zhuǎn)膜時(shí)間，高分子量蛋白可能需要更長(zhǎng)的時(shí)間，轉(zhuǎn)膜之后可以用麗春紅染色，并用預(yù)染的maker作為指示。 |
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蛋白轉(zhuǎn)移透膜 |
降低電壓或者時(shí)間當(dāng)分子量小于10kd時(shí) |
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等電點(diǎn)大于9 |
使用更高ph值的溶液體系（pH10.5） |
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二抗使用錯(cuò)誤 |
二抗的種屬錯(cuò)誤 |
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過(guò)期的抗體 |
購(gòu)買新抗體 |
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抗體的不正確儲(chǔ)存 |
依據(jù)生產(chǎn)商手冊(cè)，避免反復(fù)凍融 |
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抗體的不正確儲(chǔ)存 |
避免二抗中含有疊氮鈉，它能催眠HRP信號(hào) |
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一抗結(jié)合時(shí)間不足 |
4度過(guò)夜孵育 |
2、微弱的條帶（weak single）
較少洗膜次數(shù)或者縮短洗膜時(shí)間；
降低洗膜液中NaCl的濃度（0.15M-0.5M）；
可能存在的原因
解決辦法
蛋白與抗體結(jié)合率低
抗體量不足
抗體和蛋白的結(jié)合較低，可將抗體濃度調(diào)整至初始濃度的2-4倍
蛋白量不足
增加蛋白上樣量
酶和底物時(shí)效
將酶和底物進(jìn)行反應(yīng)，觀察現(xiàn)象，出現(xiàn)異常，則需要重新標(biāo)記或者購(gòu)買
過(guò)期或者陳舊的ECL發(fā)光液
更換的新的ECL發(fā)光液
脫脂奶粉可能會(huì)掩蓋一些抗原
降低牛奶的百分比或者用BSA代替
3、額外的條帶（Extra Bands）
| 可能的原因 | 解決方法 |
| 一抗的非特性結(jié)合 | 降低抗體濃度；減少總蛋白的上樣量；免疫親和層析純化抗體 |
| 二抗的非特異性結(jié)合 | 跑一個(gè)二抗的陰性對(duì)照（不孵育一抗）；將二抗進(jìn)行免疫親和層析 |
| 一抗或者二抗的非異性結(jié)合 |
添加0.1%-0.5%的吐溫20到抗體稀釋也中； 用2%的脫脂奶粉溶解抗體，并適當(dāng)調(diào)整抗體濃度；增加洗膜液中NaCl的濃度（0.15M-0.5M）；增加洗膜時(shí)間或者次數(shù)； |
| 蛋白聚急 | 提高DTT的濃度，加樣前加熱煮沸5-10min |
| 蛋白的降解 | 避免反復(fù)凍融；添加蛋白酶抑制劑；制備新鮮樣品； |
| 試劑污染 | 配置新鮮的給中溶液 |
4、高背景（High Background）
| 可能的原因 | 解決辦法 |
| 一抗的非特異性結(jié)合 | 免疫親和層析純化抗體；調(diào)整一抗稀釋液中奶粉的百分比和NaCl的濃度；降低抗體濃度 |
| 二抗的非特異性結(jié)合 | 跑一個(gè)二抗的陰性對(duì)照（不孵育一抗）； |
| 封閉不充分 | 用TBST（pH7.5）配制5%的脫脂奶粉，調(diào)節(jié)其中吐溫20的百分比和其中NaCl的濃度。吐溫的變化范圍0.1%-0.5%；NaCl的濃度范圍是0.15M-0.5M；延長(zhǎng)封閉時(shí)間 |
| 脫脂奶粉可能含有目標(biāo)抗原 | 用5%的BSA代替 |
| 脫脂奶粉含有內(nèi)源性生物素或者與抗生物素蛋白/鏈霉親和素不相溶 | 用5%的BSA代替 |
| 某些抗體可能識(shí)別牛奶蛋白 | 用5%的BSA代替 |
| 洗膜不充分 | 增加洗膜次數(shù)，提高吐溫20 的百分比 |
| 過(guò)度曝光 | 縮短曝光時(shí)間 |
5、 膜上散在不均勻的污點(diǎn)
| 可能的原因 | 解決辦法 |
| 試劑污染 | 更換新鮮的試劑 |
| 在抗體孵育或洗膜中液體量不夠 | 確保在抗體孵育和洗膜過(guò)程中，液體總量足夠 |
| 轉(zhuǎn)膜有氣泡 | 再轉(zhuǎn)膜過(guò)程中確保氣泡排干凈 |
| 抗體孵育過(guò)程中呈現(xiàn)不均勻分布 | 抗體配制均勻，最好在搖晃的條件下孵育 |
| 器具被污染 | 確保在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中所有用到器具設(shè)備要洗滌干凈 |
| 曝光時(shí)間過(guò)長(zhǎng) | 縮短曝光時(shí)間 |
